کیت ارزیابی شکست DNA اسپرم

Sperm DNA Fragmentation Assay Kit

خلاصه

کاربرد: کیت ارزیابی شکست DNA اسپرم (SDFA) با ارزیابی وضعیت یکپارچگی مولکول DNA اسپرم و محاسبه ایندکس شکست DNA

بروشور SDFA KIT (دانلود)

پروانه ساخت SDFA KIT (دانلود)

اطلاعات کلی

کاربرد: آنالیز روتین مایع منی اولین روش در ارزیابی وضعیت باروری مردان میباشد. این روش اطلاعات مفیدی را راجع به تعداد، حرکت، مورفولوژی، میزان زنده بودن اسپرمها و عملکرد گنادها در اختیار قرار میدهد. با این وجود، این ارزیابی هیچ اطلاعاتی راجع به یکی از مهمترین پارامترها یعنی یکپارچگی مولکول DNA که برای قدرت باروری اسپرم و رشد جنین ضروری میباشد ارائه نمیدهد. میزان اسپرمهای دارای DNA سالم در مایع منی میتواند به عنوان یک فاکتور پیشگویی کننده در ارزیابی باروری مردان و احتمال حاملگی مد نظر قرار گیرد. در واقع وجود شکستهای DNA با کاهش قدرت باروری مردان، ناباروری و سقط جنین همراه است.
کیت ارزیابی شکست DNA اسپرم (SDFA) با ارزیابی وضعیت یکپارچگی مولکول DNA اسپرم و محاسبه ایندکس شکست DNA (DFI) اطلاعات با ارزشی در رابطه با وضعیت بیماران مراجعه کننده به مرکز درمان ناباروری جهت انتخاب پروتکل درمانی مناسب در اختیار پزشک معالج قرار میدهد.

شرایط و مدت زمان نگهداری: پس از دریافت و هربار استفاده، اجزای کیت در دمای 8-2 درجه سانتیگراد نگهداری شود.

اندیکاسیون ها: اولیگو استنو تراتو زواسپرمی، ناباروری مردانه با علت نامشخص، سابقه سقط مکرر جنین، واریکوسل، تماس با سموم و آلاینده ها، بررسی کارایی درمانهای دارویی، توقف رشد جنین، کیفیت نامطلوب جنین، ارزیابی باروری پس از درمان های سرطان.
با توجه به اینکه انجام سیکل های کمک بارور(ART) پرهزینه و زمانبر می باشند، ارزیابی میزان شکست DNA اسپرم قبل از شروع سیکل های درمانی برای همه زوجین توصیه می گردد.

اصول آزمون: این آزمون بر پایه میزان گسترش کروماتین اسپرم بنا شده است. در این روش پس از قرار دادن اسپرم ها در بستری از میکروژل بر روی لام های مخصوص، از اسید برای دناتوره کردن استفاده می شود. در ادامه با استفاده از محلول لیز، پروتئین های اسپرم حذف می گردند. در نهایت توسط محلول رنگ آمیزی میزان گسترش مولکول DNA اسپرم به صورت هاله در اندازه های مختلف (بر اساس میزان یکپارچگی DNA) در اطراف هسته قابل رویت می شود.

محتویات کیت: هر کیت دارای محتویات مورد نیاز جهت انجام آزمون برای 25 نمونه می باشد.
اجزای کیت عبارتند از
- 25عدد لام کوت شده
- محلول A ( 30 میلی متر)
- محلول B ( 30 میلی متر)
- محلول C ( 30 میلی متر)
- محلول D ( 30 میلی متر)
- فوم جهت شناورسازی میکروتیوب ها
- بروشور

سایر مواد و وسایل مورد نیاز جهت انجام آزمون :
- میکروسکوپ نوری

- هود شیمیایی
- یخچال
- بن ماری
- سمپلر و سر سمپلر
- لامل
- پتری دیش
- اتانول 70، 90 و 100 درصد
- آب مقطر
- بافر فسفات سالین (PBS) با PH 7/4- 7/2
- دستکش و ماسک

آماده سازی نمونه : ابتدا نمونه تازه مایع منی در ظرف استریل جمع آوری شود (از نمونه ذوب شده مایع منی نیز میتوان استفاده کرد). پس از آب شدن نمونه (Liquefaction) و ارزیابی غلظت اسپرم، دو بار شستشو با PBS با دور 400-300 g به مدت 5 دقیقه انجام شود. در نهایت رسوب حاصل با استفاده از PBS تا میزان 10-5 میلیون اسپرم در هر میلی لیتر رقیق گردد.

کنترل های مثبت و منفی:
- کنترل مثبت: به منظور تهیه کنترل مثبت می توان یک نمونه اسپرم را در بن ماری جوش به مدت 30 دقیقه انکوبه کرد و یا آن را در معرض اشعه فرابنفش (UV) و یا محلول بازی هیدروکسید سدیم (NaOH) قرار داد.
- کنترل منفی: به منظور تهیه کنترل منفی میتوان از نمونه اسپرم پروسس شده فرد دارای DFI طبیعی استفاده نمود.

روش استفاده

کارایی پروتکل زیر برای کیت ارزیابی شکست DNA اسپرم (SDFA) با ارزیابی وضعیت یکپارچگی مولکول DNA اسپرم و محاسبه ایندکس شکست DNA (DFI) اطلاعات با ارزشی در رابطه با وضعیت بیماران مراجعه کننده به مرکز درمان ناباروری جهت انتخاب پروتکل درمانی مناسب در اختیار پزشک معالج قرار میدهد و این پروتکل صرفاً به عنوان یک مثال ارائه می‌گردد:

1- قرار دادن میکروتیوب حاوی ژل در فوم تعبیه شده در کیت و غوطه ورسازی آن در بن ماری 95-85 درجه به مدت 5 دقیقه یا تا زمانیکه ژل کاملا ذوب گردد.
2- قرار دادن میکروتیوب حاوی ژل ذوب شده در دمای محیط به منظور هم دما شدن با محیط (در حدود 3-2 دقیقه)
3- اضافه کردن 50 میکرولیتر از نمونه اسپرم آماده سازی شده به میکروتیوب حاوی ژل و همگن کردن آن
4- قرار دادن 20 میکرولیتر از مخلوط فوق بر روی لام مخصوص و بلافاصله قرار دادن لامل روی آن (از ایجاد حباب پرهیز شود)
5- قرار دادن لام در یخچال 8-2 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه
6- برداشتن لامل به آهستگی از روی لام
7- قرار دادن لام در داخل پتری دیش و افزودن محلول A و نگهداری آن در تاریکی به مدت 7 دقیقه در دمای محیط
8- تخلیه آهسته محلول A و افزودن محلول B و نگهداری آن به مدت 15 دقیقه در دمای محیط
9- تخلیه آهسته محلول B و افزودن آب مقطر و نگهداری به مدت 3 دقیقه
10- تخلیه آهسته آب مقطر و افزودن اتانول 70 ،90 و 100 درصد به ترتیب هر کدام به مدت 2 دقیقه
11- خشک کردن کامل لام در دمای محیط

12- افزودن محلول C به اندازه (3-2 قطره) و بلافاصله محلول D به اندازه (3-2 قطره)، تکان دادن آهسته لام جهت مخلوط شدن دو محلول و نگهداری به مدت 15 دقیقه

13- شستشوی لام با جریان آهسته PBS
14- خشک کردن لام و مشاهده با میکروسکوپ نوری با درشت نمایی 1000x
15- شمارش حداقل 400 اسپرم و محاسبه DFI

تفسیر نتایج:

اسپرم سالم بدون شکست DNA
1- اسپرم دارای هاله بزرگ (Large halo): هاله ای که عرض آن مشابه و یا بزرگتر از قطر هسته می باشد (b).
2- اسپرم دارای هاله متوسط (Medium halo): هاله ای که عرض آن بین هاله بزرگ و کوچک است (c).

اسپرم دچار شکست DNA
1- اسپرم دارای هاله کوچک (Small halo): هاله ای که عرض آن کوچک تر و یا برابر یک سوم قطر هسته می باشد (d).
2- اسپرم فاقد هاله (No halo) (e).
3- اسپرم فاقد هاله با هسته تخریب شده، نامنظم و با رنگ پذیری ضعیف (Degraded) (f).

هشدارها

1- از تماس محتویات کیت با پوست و چشم و نیز استنشاق آنها اکیدا خودداری شود.
2- در زمان آزمون از دستکش و ماسک استفاده گردد.
3- محل انجام آزمون دارای تهویه هوای مناسب باشد.
4- دفع پسماندها با رعایت اصول ایمنی آزمایشگاه صورت گیرد.
5- از خوردن و آشامیدن در حین آزمون اکیدا خودداری شود.